伯氏疟内质网塑形蛋白SEY1敲除质粒的构建及转染

《天津医科大学学报》-2019年第4期 论 著 文章编号 员园园远原愿员源苑渊圆园19冤园4-0324-05 基金项目 天津市教委科研计划项目（11601501/2016KJ0138） 作者简介刘影（1993-），女，硕士在读，研究方向：免疫学；通信作者： 王倩，E-mail: wangq@。 伯氏疟内质网塑形蛋白 SEY1敲除质粒的构建及转染 刘 影 1，史小雨 1，王 倩 1 渊 1.天津医科大学基础医学院免疫学系袁天津 300070冤 摘要 目的：为了研究重要内质网塑形蛋白 SEY1在疟原虫致病性方面的作用袁本研究构建敲除伯氏疟原虫 PbSEY1的质粒袁 结合疟原虫转染技术筛选 PbSEY1缺失疟原虫突变体遥 方法：选取 PbSEY1编码区中相邻的两个片段作为同源臂进行 PCR扩 增袁并引入特定酶切位点袁借助 T4 DNA连接酶和 In-Fusion无缝克隆的方法将其插入载体 pL0034中曰利用疟原虫同步化培养 及电转染技术将该质粒转入疟原虫袁基于基因同源重组原理在疟原虫中敲除 PbSEY1并进行药物筛选遥结果：渊 1冤获得可用于基 因敲除及回复实验的重组质粒 pL0034-吟PbSey1曰渊 2冤在伯式疟原虫中敲除 PbSEY1遥 结论：利用重组质粒 pL0034-吟PbSey1和 疟原虫转染技术初步获得 PbSEY1缺失疟原虫突变体袁为进一步研究 PbSEY1在疟原虫致病性中的作用提供了必要工具遥 关键词 伯式疟原虫曰PbSEY1曰pL0034曰疟原虫转染 中图分类号 R784 文献标志码 粤 Construction of Plasmodium berghei ER-shaping protein SEY1 knockout plasmid and Plasmodium transfec原 tion LIU Ying1, SHI Xiao-yu1, WANG Qian1 渊 1. Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China) Abstract Objective: To investigate the role of endoplasmic reticulum-shaping protein SEY1 in Plasmodium virulence, and to construct pL0034 -吟PbSey1 plasmid to transfect it to Plasmodium berghei to obtain PbSEY1 -deleted parasite strain. s院Two adjacent segments within PbSEY1 coding sequence were amplified by PCR as the homologous recombination arms and inserted into the pL0034 vector by T4 DNA ligase and In-Fusion cloning kit. The recombinant plasmid was transfected into Plasmodium berghei by synchronized culture and electro -transfection in order to delete PbSEY1 based on homologous recombination. Results:渊 1冤The plasmid pL0034 - 吟PbSey1 aiming at knockout and rescue experiments was obtained.渊 2冤 PbSey1 was deleted in Plasmodium berghei. Conclusion: Utilizing the recombinant plasmid pL0034-吟PbSey1 and Plasmodium transfection, PbSey1-deleted parasites could be acquired, and may be a necessary tool for further study of PbSey1 in Plasmodium virulence. Key words Plasmodium; PbSEY1; pL0034; Plasmodium transfection 疟疾渊 Malaria冤是由疟原虫渊 Plasmodium冤引起 的袁 以按蚊为主要传播媒介的全球性寄生虫病袁以 非洲地区的发病率和死亡率最高遥 我国的疟疾传染 由于灭蚊等努力一度绝迹袁但近年来在南方一些省 份已显死灰复燃之势袁且面临着严重耐药问题 [1-3]遥 目前疟疾相关研究过多的集中在疫苗和药物研发袁 却忽略了对疟原虫生物学机理的探索遥 疟原虫作为一种真核生物袁其致病性及宿主的 免疫应答都与疟原虫的蛋白质分泌密切相关遥疟原 虫分泌的蛋白不仅嵌入自身质膜袁还会进入纳虫泡 腔以及宿主细胞的胞浆袁甚至还会嵌入宿主细胞的 质膜中 [4-5]袁在细胞黏附尧免疫隔离尧信号传递等多 个过程发挥重要作用 [6-7]袁以创造更利于自身生长 发育的环境遥因此袁研究疟原虫蛋白质分泌过程袁特 别是与蛋白分泌密切相关的细胞器要内质网渊 en原 doplasmic reticulum袁ER冤袁对探究疟原虫的致病机制 尤为重要遥 内质网是真核生物中最大的膜包被细胞器袁由 不间断的片状和管状结构组成遥 内质网参与多种重 要细胞活动袁均与其形态特征密切相关袁特别是蛋 白质分泌功能[8]遥 多个整合膜蛋白家族成员已被发 现参与内质网形态的维持袁如 DP1尧Atlastin和 RTN 等遥 笔者在前期研究中发现袁真核细胞的内质网塑 形蛋白渊 ER-shaping protein冤Atlastin袁属于 dynamin 超家族的 GTP酶袁主要通过介导同源膜融合来构建 内质网管状网络[9-10]袁其缺失会减少COP II囊泡的形 成袁从而影响内质网中合成加工蛋白的运输[11]袁说明 内质网正常形态的维持与蛋白质分泌功能密切相 关遥 此前已有研究尝试观察红外期和红内期疟原虫 内质网形态[12]袁但疟原虫内质网的具体功能及其在 疟原虫致病性方面的作用目前尚无研究遥 通过疟原 灾燥造援 25熏 晕燥援 4Jul. 圆园19第 25卷 4期圆园19年 7月 天津医科大学学报 Journal of Tianjin Medical University324 虫基因组分析袁 笔者在伯氏疟原虫渊 Plasmodium berghei, P. berghei冤中找到哺乳动物 Atlastin蛋白的 同源蛋白 PbSEY1渊 P. berghei SEY1冤遥 SEY1在其他 细胞内质网形态和功能维持中很重要袁然而袁笔者 目前并不了解它如何在疟原虫中发挥功能袁以及这 些功能与蛋白质分泌及疟原虫致病性之间的关系遥 为了探究伯式疟原虫内质网塑形蛋白 PbSEY1 在疟原虫寄生及致病过程中的作用袁本研究利用敲 除-回复载体 pL0034袁 构建 pL0034-吟PbSey1重组 质粒袁 结合疟原虫转染技术袁 基于单交换渊 single crossover冤的同源重组渊 homologous recombination冤原 理袁将 PbSey1从疟原虫基因组中敲除袁构建 PbSey1 缺失的疟原虫突变体袁且在后续回复实验中袁该突 变体在药物作用下可直接恢复 PbSey1 的表达袁为 探究内质网塑形蛋白 PbSey1在疟原虫致病性方面 的作用提供了有力的工具遥 1 材料与方法 1.1 实验材料 伯氏疟原虫 P. berghei ANKA由罗 格斯大学新泽西医学院 Purnima Bhanot教授赠予袁 大肠杆菌载体 pL0034于本实验室保存渊 图 1冤袁克隆 感受态细胞 Mach1-T1购自北京博迈德基因技术有 限公司袁质粒提取试剂盒购自 QIAGEN 公司袁质粒 小量抽提试剂盒和 DNA 凝胶回收试剂盒均购自 TransGen Biotech公司袁 限制性核酸内切酶 EcoRV尧 NotI尧KpnI 及 T4 DNA 连接酶购自 ThermoFisher 公 司袁乙胺嘧啶购自 Sigma公司袁细胞核转染试剂盒购 自 Lonza公司遥 1.2 实验方法 1.2.1 目的基因片段 Segment I 和 Segment II 的获 取 以野生型伯氏疟原虫 PbSey1 基因的编码区 渊 1-2742bp冤为模板袁分别扩增两个片段 Segment I渊 S I袁26-1059bp冤和 Segment II渊 S II,1050-1958bp冤袁并 在两个片段上下游分别引入 KpnI尧EcoRV和 KpnI尧 NotI酶切位点渊 PCR引物见表 1冤遥 PCR条件为院94 益 预变性 30 s袁 以 98 益 10 s袁58 益 1 min袁68 益 1 min袁 循环 35次袁68 毅C 5 min袁4 毅C终止反应遥琼脂糖凝胶 电泳确定 PCR产物片段大小正确后切胶回收袁再将 片段 S II经 KpnI尧NotI酶切袁酶切产物纯化后备用遥 1.2.2 重组质粒 pL0034-吟PbSey1 的构建 先将 片段 S II通过酶切位点 KpnI和 NotI 与 pL0034 在 T4 DNA连接酶的催化下 16 益连接过夜袁 次日将连 接产物转化至感受态细胞 Mach1-T1中袁 在含有氨 苄的固体培养基上 37 毅C倒置培养 12 h袁 挑取阳性 单克隆后摇菌扩增提取质粒遥 酶切鉴定及 DNA测 序确认片段 S II插入无误后袁 利用 In-Fusion无缝 克隆的方法将片段 S I与 KpnI和 EcoRV双酶切后 的质粒 pL0034-S II连接渊 条件为 50 毅C袁30 min冤袁将 连接产物转化至感受态细胞后进行氨苄筛选培养袁 挑取单克隆进行扩增并提取质粒袁酶切鉴定及 DNA 测序确认片段 S I插入正确遥 1.2.3 疟原虫转染 将液氮中冻存的伯氏疟原虫 感染血液通过尾静脉注射感染Wistar大鼠遥 每日鼠 尾取血制备薄血片袁Giemsa染色袁 油镜观察并计算 虫血率遥 待虫血率升至 3%耀5%时袁心脏取血收集大 鼠血液袁加入 10 mL完全培养基袁离心渊 200 g袁8 min冤袁 弃去上清后将全部血细胞沉淀转移至 150 mL完全 培养基中袁 充入 5% CO2尧5% O2尧90% N2混合气体袁 于 500 mL密封锥形瓶中袁37 毅C尧77耀80 r/min条件下 培养 16耀23 h遥 次日制备血涂片检查培养状况袁若 80%左右疟原虫发育为成熟裂殖体即可进行分离纯 化遥将培养液体分至 4个 50 mL离心管中袁每管 35mL袁 在底部缓慢加入 10 mL Nycodenz/PBS溶液渊 密度梯 度溶液冤袁使二者产生明显界面袁离心渊 200 g袁25 min冤遥 离心后在培养基与密度梯度离心液之间形成一个 棕色液体薄层袁即为裂殖体细胞层袁用吸管小心将 该层吸出袁完全培养基洗涤 1 次袁弃净上清后置于 冰上备用遥 将 100 滋L Nucleofector溶液尧10 滋g重组 图 1 pL0034质粒图谱 Fig 1 Plasmid profile of pL0034 目的片段 Segment I Segment II 引物序列渊 5忆寅3忆冤 CCTTCAATTTCGATGGGTACCTAATCGACTATGATG TAAACTTTTTTCAATGATATCTTTTTCTGCCCAGG GGTACCAAAAGATATCATTG GCGGCCGCTTATTTTGGTCTATTTC 引物名称 F311 R312 F402 R414 表 1 目的片段 PCR扩增引物 Tab 1 PCR primers 下划线部分表示引入的酶切位点 刘 影袁等.伯氏疟内质网塑形蛋白 SEY1敲除质粒的构建及转染第 4期 325 质粒及 30 滋L分离得到的裂殖体混合电击后袁尾静 脉注入 BALB/c小鼠袁 再经乙胺嘧啶筛选获得成功 转染的疟原虫遥 2 结果 2.1 疟原虫 PbSey1基因敲除及回复策略 以野生 型伯氏疟原虫 Sey1基因编码区为模板构建的质粒 pL0034-吟PbSey1袁 转染后首先进行第一次同源重 组 渊 图 2A冤袁 发生重组的同源臂为 Segment II袁使 Sey1因片段缺失及无启动子而无法表达袁即只有发 生 Segment II重组的疟原虫才能产生吟Sey1的基因 型袁同时表达抗药标签 hDHFR渊 human dihydrofolate reductase冤袁可在乙胺嘧啶渊 pyrimethamine冤筛选中存 活袁最终经单克隆筛选即可得到敲除 Sey1的疟原虫遥 获得 PbSey1缺失疟原虫突变体后即可观察其 表型并进行相关功能实验遥 为了满足后续回复实验 的需求袁本文所使用的基因敲除策略在进行回复实 验时无需重新构建回复质粒袁只需在药物筛选作用 下发生第二次单交换的同源重组即可得到 PbSey1 回补的野生基因型遥 在 5-氟胞嘧啶的作用下袁Pb- 吟Sey1 将进行第二次同源重组渊 图 2B冤袁同源臂为 Segment I袁重组可导致耐药标签 hDHFR-yFCU的丢 失而 PbSey1重新表达遥 未发生第二次重组的疟原 虫 因 含 有 标 签 yFCU 渊 yeast enzyme cytosine deaminase and uridyl phosphoribosyl transferase冤袁可 将 5-氟胞嘧啶转化为有毒性的 5-氟尿嘧啶而被杀 死袁 由此即可得到 PbSey1回补的野生型疟原虫遥 2.2 重组质粒 pL0034-吟PbSey1的构建和鉴定 由 于酶切位点设计的不同袁首先扩增和插入的片段是 Segment II渊 909bp冤渊 图 3A冤遥 在其 5忆端第 10位碱基 引入一个点突变渊 T > C冤渊 图 3C冤袁在不影响其氨基 酸编码的前提下产生酶切位点 EcoRV渊 GATATC冤袁 同时在 EcoRV渊 绿色箭头显示冤的上游引入酶切位 点 KpnI渊 蓝色箭头显示冤曰在 Segment II的 3忆端引入 酶切位点 NotI渊 红色箭头显示冤渊 图 3C冤遥 利用 KpnI 和 NotI 两个酶切位点插入 S II 即可得到质粒 pL0034-S II袁 酶切鉴定及 DNA测序证明插入片段 正确渊 图 3A冤遥 pL0034- S II 构建成功后袁 扩增尧 插入片段 Segment I渊 1034 bp冤渊 图 3B冤遥在 S I的 5忆端引入酶切 位点 KpnI渊 蓝色箭头显示冤袁与 S II相同袁在 3忆端的 末位碱基引入点突变渊 T>C冤而产生酶切位点 EcoRV 渊 绿色箭头显示冤渊 图 3C冤遥 利用 In-Fusion无缝克隆 方法将 S I 插入质粒 pL0034 -S II袁 即得到质粒 pL0034-吟PbSey1袁KpnI 和 NotI 酶切鉴定及 DNA 测序证明插入片段正确渊 图 3B冤遥 最后经 EcoRV酶 切将质粒线性化后即可用于疟原虫转染遥 A.质粒 pL0034-吟PbSey1以 Segment II为同源臂进行第一次同源重 组袁得到吟PbSey1疟原虫遥 B.质粒 pL0034-吟PbSey1以 Segment I为 同源臂进行第二次同源重组袁得到 PbSey1回补后的野生型疟原虫 图 2 疟原虫 PbSey1基因敲除及回复策略 Fig 2 PbSey1 knockout and rescue strategy in Plasmodium A:目的片段 S II的获取及质粒 pL0034-S II的双酶切鉴定遥 B:目的片 段 S I的获取及质粒 pL0034-吟PbSey1的双酶切鉴定遥 C:片段 S II中 利用碱基点突变渊 T>C冤引入 EcoRV曰S I尧S II的酶切位点图示 图 3 重组质粒 pL0034-吟PbSey1的构建和鉴定 Fig 3 Construction and identification of recombinant plasmid pL0034 - 吟PbSey1 A M SII M 1 000 bp750 bp 1 000 bp750 bp 1 000 bp750 bp 1 000 bp750 bp M S I M B C 第 25卷天津医科大学学报326 2.3 疟原虫转染及重组子的鉴定 伯氏疟原虫经 同步化培养后约 80%的疟原虫均已发育为成熟裂 殖体袁在此阶段进行转染效率最高遥 经电转后的疟 原虫在小鼠体内生长袁每日监测血涂片袁100倍油镜 下观察 100个视野袁 若观察到疟原虫即为阳性袁未 找到则为阴性遥 转染后次日即出现疟原虫阳性袁于 小鼠饮水中加入乙胺嘧啶袁 给药 2 d后血涂片疟原 虫转为阴性袁遂撤药遥 停药后第 5天疟原虫再次转 为阳性袁至停药后第 9天虫血率长至 5%袁心脏取血 纯化疟原虫袁提取基因组 DNA袁 PCR鉴定及 PCR产 物 DNA 测序结果提示成功获得 PbSey1 缺失疟原 虫突变体袁 但为混合克隆袁PCR条带灰度分析显示 PbSey1缺失疟原虫突变体约占 50%渊 表 2袁图 4冤遥 3 讨论 内质网作为真核细胞蛋白质合成尧脂质合成和 钙储存的关键细胞器袁其结构和功能对真核生物的 生存和繁殖极为重要袁对于疟原虫也是如此遥 内质 网塑形蛋白 SEY1通过介导内质网同源膜融合参与 管状网络结构的形成袁 若 SEY1缺失将会对内质网 的形态和功能以及细胞的生长发育造成影响遥 在哺 乳动物中袁Atlastin GTP酶渊 同源蛋白 SEY1冤的缺失 会影响 COP II包被囊泡的出芽生长袁从而对内质网 合成蛋白的运输产生负作用曰人体内 Atlastin渊 ATL冤 的缺失会造成遗传性痉挛性截瘫渊 hereditary spastic paraplegia袁HSP冤 [13 ]曰在拟南芥植物袁其同源蛋白 RHD3渊 root hair defective 3冤的缺失则会影响生长素 水平及生长素运输机制稳态袁 从而引起植物矮小袁 根毛变短和卷曲 [14]曰在果蝇中袁ATL 缺失会导致其 神经元缺陷 [15]曰在白色念珠菌中袁内质网的膜融合 延迟甚至片段化则会使其毒力和致病力降低[16]遥 这 些研究结果都为笔者研究 PbSEY1在疟原虫内质网 中的作用提供了依据和方向袁 促使笔者继续探究内 质网塑形蛋白 PbSEY1在疟原虫生长和致病过程中 的作用遥 在疟原虫中进行某种蛋白功能研究时袁除了敲 除该种蛋白外袁对敲除株进行蛋白回补也是必不可 少的实验步骤遥 在本研究中袁笔者利用基因同源重 组原理及质粒 pL0034 上药物筛选标签 hDHFR 和 yFCU袁将基因敲除和基因回复两个截然相反的实 验目的融合在一个重组质粒中袁避免了后期因回复 实验而重复构建质粒及再次进行疟原虫转染[17]遥 此 外袁 该质粒在进行 PbSEY1的基因回复时是在疟原 虫基因组中 PbSEY1的原位进行回复袁 其表达量仍 与野生型疟原虫一致袁 对基因组的其他序列也不会 产生影响袁 确保了回复后疟原虫基因组的完整性和 准确性遥 通过疟原虫同步化培养和转染技术成功在伯 氏疟原虫中敲除 PbSEY1袁获得了 PbSEY1缺失疟原 虫与野生型疟原虫的混合克隆遥 这是由于在乙胺嘧 啶药物筛选过程中少量未发生同源重组的野生型 疟原虫自发突变袁获得耐药性而存活下来遥 对于混 合克隆袁常规应进行单克隆筛选袁但笔者在进行单 克隆筛选时却遇到了重重困难遥 笔者常规采用稀释 法进行单克隆筛选袁即每只小鼠仅尾静脉注射 1个 疟原虫袁 经多次尝试却始终无法得到 PbSEY1缺失 的单克隆虫株遥据此袁推测 PbSEY1与其他物种中的 同源蛋白有所不同袁可能在疟原虫血液阶段的生长 发育过程中发挥着至关重要的作用 袁 以至于 PbSEY1敲除虫株无法单独存活袁 其在疟原虫致病 性方面的具体作用机制还有待于结合其它分子工 具进一步深入研究遥 综上所述袁 内质网膜塑形蛋白 SEY1及其同源 蛋白在细胞内有着不可或缺的作用袁笔者推测在疟 原虫体内更是如此遥 本研究成功构建了 PbSEY1敲 除-回复重组质粒 pL0034-吟PbSey1袁建立了稳定的 疟原虫转染平台袁 为后续深入研究 SEY1蛋白在疟 原虫中的具体功能提供了有利工具遥 参考文献： [1] Caraballo H, King K. Emergency department management of mosquito- M.Marker曰1.模板为野生型疟原虫基因组 DNA袁引物为 F28+R34曰 2.模板为野生型疟原虫基因组 DNA袁引物为 F32+R105曰3.模板为转 染后药物筛选出的疟原虫基因组 DNA袁引物为 F28+R34曰4.模板为转 染后药物筛选出的疟原虫基因组 DNA袁引物为 F32+R105 图 4 疟原虫转染后重组子的鉴定 Fig 4 PCR identification of PbSey1-deleted Plasmodium integrants 疟原虫株 引物名称 引物序列渊 5忆寅3忆冤 产物长度 Wildtype F28 ATGACGGATGTAAACAAAACTC 2 056 bp Parasites R34 TTAAATCATTATTTATCGTACTAAC 吟PbSey1 F32 TATATCTGAAAGGTATGTCTTC 379 bp Parasites R105 TACATGCATGTGCATGCACA 表 2 PCR鉴定 PbSey1敲除疟原虫引物 Tab 2 PCR identification primers of PbSey1-deleted parasites M 1 2 3 4 2 000 bp 500 bp 250 bp 刘 影袁等.伯氏疟内质网塑形蛋白 SEY1敲除质粒的构建及转染第 4期 327 [9] Tuma D J, Casey C A, Sorrell M F. Effects of ethanol on hepatic protein trafficking: impairment of receptor-mediated endocytosis[J]. Alcohol Alcoholism, 1990, 25(2/3):117 [10] Lin Y L, Wang P Y, Hsieh L L, et al. 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